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如何進(jìn)行ELISA的優(yōu)化?

更新時(shí)間:2024-04-02      點(diǎn)擊次數(shù):673

檢測(cè)的每個(gè)組成部分包括一抗和二抗、封閉劑、緩沖液、酶綴合物和底物,可以對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化,以提高新開發(fā)的ELISA工作方案的性能。測(cè)試了不同濃度和時(shí)間的包被、封閉、樣品培養(yǎng)和檢測(cè)步驟,以找到檢測(cè)的最佳條件。通常,一次測(cè)試一種成分,然而在某些情況下,可以通過應(yīng)用棋盤滴定網(wǎng)格方法同時(shí)優(yōu)化兩種成分,如下所示:

image.png

圖2:棋盤滴定網(wǎng)格法同時(shí)優(yōu)化兩種ELISA成分。本例顯示了組件A與組件B的對(duì)比,所有其他組件保持不變。

優(yōu)化涂層過程

可以在包被緩沖液中制備不同濃度的包被劑(靶抗原或捕獲抗體),并且可以應(yīng)用等體積的每種濃度來執(zhí)行ELISA方案,以發(fā)現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)對(duì)低背景的趨勢(shì)。在某些情況下,根據(jù)涂布劑的性質(zhì),可能還需要優(yōu)化涂布緩沖液和平板涂布時(shí)間的選擇。

優(yōu)化阻塞過程

可以使用ELISA方案測(cè)試相同體積的不同制備的或市售的封閉溶液,以確保非特異性結(jié)合最少,而不會(huì)影響檢測(cè)信號(hào)強(qiáng)度。如果封閉溶液是內(nèi)部制備的,可以調(diào)節(jié)不同濃度的封閉劑。

優(yōu)化樣品濃度

用于樣品制備以生成校準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑應(yīng)盡可能模擬天然樣品基質(zhì)并測(cè)試不同的成分。用ELISA方案測(cè)試相同體積的連續(xù)稀釋樣品濃度??梢源_定樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度和稀釋線性的良好動(dòng)態(tài)范圍。樣品稀釋劑可能需要根據(jù)動(dòng)態(tài)范圍的光譜進(jìn)行調(diào)整。

優(yōu)化檢測(cè)過程

在標(biāo)準(zhǔn)稀釋液中制備的不同濃度的檢測(cè)抗體可以用ELISA方案進(jìn)行等體積測(cè)試,以找到適合強(qiáng)信號(hào)和低背景噪聲的濃度。

辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶是ELISA中常用的兩種報(bào)告酶。在標(biāo)準(zhǔn)稀釋劑中制備的不同濃度的酶綴合物或酶綴合的二抗通過測(cè)試板中每種濃度的等體積并進(jìn)行ELISA方案進(jìn)行優(yōu)化??梢源_定產(chǎn)生具有最小背景噪聲的強(qiáng)信號(hào)的濃度。底物需要對(duì)在動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)清晰檢測(cè)的靶抗原敏感,并且能夠用合適的儀器檢測(cè)。

下表列出了包被和檢測(cè)抗體及酶偶聯(lián)物的推薦濃度范圍,可用于確定比色ELISA優(yōu)化的最合適實(shí)驗(yàn)條件。對(duì)于酶綴合物,查看制造商的說明書以了解更具體的濃度范圍。可以使用未純化的抗體,但可能需要比純化抗體更高的濃度,并可能導(dǎo)致更高的背景噪聲。建議使用親和純化的抗體以獲得最佳信噪比。建議的濃度范圍僅供參考;每個(gè)組件的單獨(dú)優(yōu)化將提供更好的結(jié)果。

表2:包被和檢測(cè)抗體和酶綴合物的推薦濃度范圍

試劑

包被抗體

檢測(cè)抗體

酶交聯(lián)物

血清

5-15克/毫升

1-10克/毫升

-

粗制腹水

5-15克/毫升

1-10克/毫升

-

親和純化的多克隆抗體

1-12克/毫升

0.5-5克/毫升

-

親和純化的單克隆

1-12克/毫升

0.5-5克/毫升

-

HRP

-

-

0.02–0.2克/毫升

AP

-

-

0.1–0.2克/毫升



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